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數(shù)字PCR技術(shù)復(fù)雜生物樣本中DNA/RNA絕對(duì)定量的解決方案 已有1人參與
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數(shù)字PCR技術(shù)：dPCR和qPCR(Real-time PCR)技術(shù)定量檢測(cè)DNA/RNA時(shí)抑制劑的影響對(duì)比 眾所周知，數(shù)以千種的化學(xué)物質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)有作用，而生物樣本往往都會(huì)含有類似的化合物，在DNA/RNA純化時(shí)，這類化合物很難去除，所以會(huì)存在DNA/RNA樣本中。 數(shù)字PCR技術(shù)： qPCR和Crystal dPCR進(jìn)行DNA/RNA定量的比較 qPCR (Real-time PCR)進(jìn)行DNA/RNA定量時(shí)，基于Ct值，且依賴于分析的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)未知樣品與含有已知量核酸標(biāo)準(zhǔn)品之間的Ct值得到未知樣品的濃度。但當(dāng)樣品中存在抑制劑時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間由于背景不同，所以PCR反應(yīng)效率可能不同，因此定量結(jié)果將會(huì)有偏差（圖1A）。 Naica crystal dPCR進(jìn)行DNA/RNA定量時(shí)，結(jié)果判讀在于通過(guò)熒光值區(qū)分微滴的陽(yáng)性或陰性。即使有因抑制劑存在而導(dǎo)致PCR反應(yīng)效率降低，仍然可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量（圖1B）。 數(shù)字PCR技術(shù)：qPCR和Crystal dPCR對(duì)抑制劑的耐受性比較 我們?cè)趒PCR和Crystal dPCR平臺(tái)比較了存在兩種在樣品中發(fā)現(xiàn)的已知抑制劑對(duì)DNA定量分析的影響，分別是在土壤樣本中存在的腐殖酸和在收集的血樣中用作抗凝血?jiǎng)┑母嗡亍＝Y(jié)果顯示，與qPCR相比，Crystal dPCR在任何較高濃度抑制劑存在的情況下，仍然可以進(jìn)行準(zhǔn)確定量（圖3）。 數(shù)字PCR技術(shù)：qPCR和Crystal dPCR反應(yīng)包含PerfeCta Multiplex qPCR Toughmix，相同量的人類基因組DNA，以及測(cè)試腐殖酸抑制作用的靶向BRAF基因和測(cè)試肝素抑制作用的EGRF基因的引物和探針。所有樣品進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)三個(gè)重復(fù)（利用Sigmoid即S型函數(shù)擬合）。以不添加抑制劑的DNA定量為0％抑制，計(jì)算抑制百分比。 綜上所述，當(dāng)對(duì)存在抑制劑的樣品進(jìn)行DNA/RNA分析時(shí)，Crystal dPCR可以比qPCR的結(jié)果更為可靠。Crystal dPCR是您一直在尋找的針對(duì)含抑制劑樣本中核酸檢測(cè)和定量的最佳解決方案。 |
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2019-11-05 16:54:48, 178.38 K
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2樓2020-10-12 17:25:29
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