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江湖救急 已有2人參與
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誒，慚愧。這個(gè)PCR折磨了我一個(gè)多月了。剛開(kāi)始部分能p出來(lái)，幾個(gè)挑單克隆測(cè)序不對(duì)，測(cè)序出來(lái)了3個(gè)，后面再做pcr怎么p都不出來(lái)了，用什么酶都試了一遍，退火條件也試過(guò)了，都跑不出來(lái)。用基因組DNA也不行，跑出來(lái)幾個(gè)，純化后連接轉(zhuǎn)化挑不出陽(yáng)性。PCR卡就算了，好幾個(gè)還都卡在陽(yáng)性挑不出來(lái)，好郁悶啊，后面覺(jué)得是引物可能設(shè)的不好，所以重設(shè)了引物，但是也就提高了退火，降低了上下游的差異在差中選優(yōu)，還是沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)。想問(wèn)問(wèn)有沒(méi)有有經(jīng)驗(yàn)的，想請(qǐng)教一下，是模板的問(wèn)題嗎？RNA打算重新提一下。陽(yáng)性挑不出來(lái)又該怎么調(diào)整呢，用的是重組連接酶，和這個(gè)有關(guān)系嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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2樓2019-10-30 20:53:05
3樓2019-10-30 23:05:33
Acov
新蟲(chóng) (小有名氣)
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-10-31 22:48:05
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西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-10-31 22:48:05
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首先 你這是提什么的rna rna跑膠情況圖有嗎 引物是根據(jù)什么來(lái)設(shè)計(jì)的 推薦pcr溫度多少 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
4樓2019-10-31 00:29:30
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提的水稻的RNA有兩條帶，第三條帶看不到。是不是不太好，濃度在1300ng左右，引物是按照infusion的要求設(shè)的除了酶切位點(diǎn)有15個(gè)堿基的模板匹配，剩余分別基因的cds兩端，推薦的退火在60℃左右 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
5樓2019-10-31 11:47:23
Acov
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以前p出來(lái)的條帶怎么樣 如果以前條帶可以 就還是提完rna按照以前的來(lái)試試 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
6樓2019-10-31 20:03:42
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嗯，最開(kāi)始還是能p出來(lái)幾個(gè)的，量不高夠做連接。是，現(xiàn)在就打算重提了再來(lái)p一下 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
7樓2019-10-31 20:11:50
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