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[求助]
關于PCR產(chǎn)物直接進行的平末端連接問題 已有1人參與
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請問大家，kod，pfu等高保真聚合酶擴增的片段為平末端，能否直接連接到使用平末端內(nèi)切酶切開的載體上？ 還有下面幾個問題請教大家： 1. T4 DNA聚合酶可以連接內(nèi)切酶切口3'-OH和5'-P，該5'-P為一個磷酸。而PCR擴增產(chǎn)物5'端有3個P，這樣能不能和載體上的3'-OH連接上。 2. 我看了一些資料上平末端連接需要載體去磷酸化，并且插入片段要進行磷酸化，請問插入片段的磷酸化是不是必要的，因為磷酸化的相對成本比較高。 問題有點長，麻煩各位耐心閱讀。謝謝。 |
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2樓2019-09-25 22:27:37
woshishui916
木蟲 (著名寫手)
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3樓2019-09-26 00:12:50
【答案】應助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
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洛洛洛洛洛果: 金幣+5, ★★★很有幫助 2019-09-28 10:14:37
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高保真聚合酶PCR產(chǎn)物可以連接平端載體。 天然的質粒都是磷酸化的，所以自制載體時最好去磷酸化一下，目的是為了防止載體自連。目的片段磷酸化，目的也是為了連接效率更高，但此步驟不是必要的。 正常我們做連接，都是PCR產(chǎn)物純化后，按一定比例連載體。另外T4 DNA連接酶連接時間比較長，我們實驗室現(xiàn)在用的都是TOPO載體，速度快陽性率高，樓主可以自行了解下。 |
4樓2019-09-26 09:50:10
5樓2020-03-11 15:25:31
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