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[資源]
【技術(shù)資源】PCR常見問題匯總
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PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶 PCR技術(shù)資源匯總獲�。� 鏈接：https://pan.baidu.com/s/1gGf5upD5voC31feKI2RnIA 提取碼：0h3i 【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】+【文字資料】+【引物設(shè)計(jì)軟件】+【技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南】+【逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）視頻教程】 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。 模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul�；�100ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。 物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。 克隆PCR產(chǎn)物 1)克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？ 最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。 2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？ 如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會(huì)產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。 3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗(yàn)？ A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。 B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。 例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。 鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為： 1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞 如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。 C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T�？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。 4)對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？ A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4℃過夜。 B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。 C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。 D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。 E）高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系： 10×擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。 設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。 ②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。 ③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 ⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。 ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。 ⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。 酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。 PCR反應(yīng)條件的選擇 PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。 溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。 �、僮冃詼囟扰c時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。 ②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 �、垩由鞙囟扰c時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。 PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。 |
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[考研] 材料與化工，291，求調(diào)劑 +7 | 咕嚕咕嚕123123 2026-03-05 | 8/400 |
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[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +5 | 呼呼？~+123456 2026-03-05 | 5/250 |
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[考研] 化學(xué)專業(yè)調(diào)劑 +3 | 好好好1233 2026-03-04 | 3/150 |
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[考研] 一志愿天津大學(xué)085600 319分 材料與化工 金屬方向 求調(diào)劑 +6 | 青科11 2026-03-02 | 6/300 |
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[考研] 304分材料專碩求調(diào)劑 +11 | qiuzhigril 2026-03-03 | 14/700 |
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[考研] 293求調(diào)劑 +3 | 是樂渝哇 2026-03-04 | 3/150 |
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[考研] 材料復(fù)試調(diào)劑 +7 | 學(xué)材料的點(diǎn) 2026-03-01 | 8/400 |
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[考研] 學(xué)碩材料275調(diào)劑 +9 | 路三三 2026-03-03 | 9/450 |
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[考研] 264求調(diào)劑 +3 | thext 2026-03-03 | 3/150 |
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[考研] 化工270求調(diào)劑 +10 | 什么名字qwq 2026-03-02 | 10/500 |
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[考研] 307求調(diào)劑 +6 | wyyyqx 2026-03-01 | 6/300 |
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[考研]
 高分子化學(xué)與物理調(diào)劑
+6
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好好好1233 2026-02-28 | 16/800 |
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[考研] 295求調(diào)劑。一志愿報(bào)考鄭州大學(xué)化學(xué)工藝學(xué)碩，總分295分 +8 | yl1 2026-03-02 | 9/450 |
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[考研] 材料工程274求調(diào)劑 +5 | Lilithan 2026-03-01 | 5/250 |
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[考研] 哈工大計(jì)算機(jī)劉劼團(tuán)隊(duì)招生 +4 | hit_aiot 2026-03-01 | 6/300 |
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[考研] 275求調(diào)劑 +3 | L-xin? 2026-03-01 | 6/300 |
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[考研] 322求調(diào)劑 +3 | 熊境喆 2026-03-01 | 3/150 |
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[基金申請]
剛錄用，沒有期刊號，但是在線可看的論文可以放為代表作嗎
 10+3
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arang1 2026-03-01 | 3/150 |
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[考研] 317一志愿華南理工電氣工程求調(diào)劑 +6 | Soliloquy_Q 2026-02-28 | 11/550 |
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