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史上最全點(diǎn)突變實(shí)操
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https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MzkwMDkzNw==&mid=2247483670&idx=1&sn=0c41f53854060efa0161dca05a6f55bb&chksm=fd3bd0f0ca4c59e6dfec34fe31a776cf775f3959ab29e58ab5b6f503b8bad82d2783d7889e91&token=73890196&lang=zh_CN#rd 也許大概7年前，當(dāng)導(dǎo)師告訴我要對(duì)我所研究的Xxoa蛋白做一些定點(diǎn)突變時(shí)，我的內(nèi)心是拒(bu)絕(gan)的：第一次進(jìn)行這種大實(shí)驗(yàn)，你不能讓我做，我就馬上開始做。第一我要研究一下原理，方法啊，因?yàn)槲也辉敢馐裁炊疾欢烷_始一頓忙操作，到頭來結(jié)果很壞，師兄師姐一定會(huì)覺得我很蠢，研究生剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，第一次還是要給他們眼前一亮的感覺！其次呢，做實(shí)驗(yàn)前總要準(zhǔn)備試劑，還有各種材料，兵馬未動(dòng)，糧草先行。 于是得先請(qǐng)教一下師兄師姐們：咱們有什么試劑？你們之前是怎么做的？ 師姐A:一年多前啦，好像用的是一個(gè)試劑盒。 師姐B:這個(gè)實(shí)驗(yàn)我們也不常做啊，試劑盒內(nèi)的高保真酶可能用完了。 師兄D：那個(gè)Dpn I還有，你再買一管Herculase酶吧 master p：河什么絲，師兄？ 師兄D在一張草稿紙上飛速寫下“Herculase”,然后說：喏，河口蕾絲，這是比Pfu還牛B的高保真聚合酶，趕緊買一個(gè)去吧！ 幾通電話后，輾轉(zhuǎn)聯(lián)系到了北京一家公司才算購(gòu)買到。Agilent是外國(guó)大牌，整個(gè)天津城都找不到貨——還是帝這樣的一線大城市好哎。 自那以后，Master P再也沒用過那款"河口蕾絲"的酶（主要是沒需求，沒途徑），但是已經(jīng)在定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)上小有經(jīng)驗(yàn)�，F(xiàn)在就跟隨小P來了解一下定點(diǎn)突變的原理與方法吧！ 體外誘變有多種方法，這篇主要介紹初學(xué)者最容易入門的以環(huán)形質(zhì)粒做模板，并通過Dpn I消化原始模板質(zhì)粒DNA的方法。 原理： （以下藍(lán)色字體引自《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南·第四版》相關(guān)章節(jié)） 以雙鏈DNA為模板的體外誘變：用Dpn I選擇突變體 以變性質(zhì)粒DNA作為模板，在高保真聚合酶作用下，使用兩條寡核苷酸鏈引導(dǎo)DNA合成。兩條寡核苷酸鏈內(nèi)均含有預(yù)定突變位點(diǎn)，并且兩者在質(zhì)粒DNA上的結(jié)合形成彼此反向互補(bǔ)。在該方案中，經(jīng)過多輪熱循環(huán)，雙鏈質(zhì)粒DNA的全長(zhǎng)均以線性形式擴(kuò)增，最終產(chǎn)生一種DNA雙鏈帶交錯(cuò)缺口的突變質(zhì)粒。 圖1 環(huán)形質(zhì)粒法定點(diǎn)突變示意圖 圖片來源于Agilent Quickchange定點(diǎn)突變?cè)噭┖�。如圖所示，黃綠所示為作為模板的質(zhì)粒DNA,來源于大腸桿菌；紅藍(lán)所示為經(jīng)過高保真酶擴(kuò)增而得到的具有nick(缺口，DNA鏈的磷酸二酯鍵并未閉合，此類質(zhì)粒應(yīng)歸類于開放式-環(huán)形質(zhì)粒，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與閉合環(huán)形質(zhì)粒有差異。通常，普通教科書內(nèi)講述大腸桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的時(shí)候，質(zhì)粒閉合環(huán)形，如從某個(gè)菌株提取的質(zhì)粒，或者經(jīng)過限制酶切后有經(jīng)連接酶（T4 DNA ligase 或者Taq DNA ligase）構(gòu)建而成的質(zhì)粒。非閉合環(huán)形質(zhì)粒同樣也能被大腸桿菌細(xì)胞吸收收，斷裂的nick可在質(zhì)粒進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)后被修補(bǔ)。 因?yàn)閿U(kuò)增反應(yīng)使用一定量的模板DNA,野生型質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子背景將非常高，因此需要增加富集突變體DNA的步驟。該方案通過采用可以特異性消化完全甲基化（5′-Gm6ATC-3′,Vovis and Lacks 1977）的限制酶Dpn I處理線性擴(kuò)增產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。Dpn I可以消化擴(kuò)增反應(yīng)體系中的來自大腸桿菌的模板DNA,對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA則不能消化。未被消化的突變開環(huán)質(zhì)粒DNA可通過轉(zhuǎn)化并篩選帶有抗生素抗性的大腸桿菌，最終獲得的是還有預(yù)突變位點(diǎn)的完整的突變體質(zhì)粒（在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制，提取質(zhì)粒獲得）。根據(jù)誘變體的復(fù)雜程度和模板長(zhǎng)度不同，最終將有15-80%的轉(zhuǎn)化子含有所需要突變的質(zhì)粒（Weiner,1994） 該方法成功的關(guān)鍵在于引物的設(shè)計(jì)和選擇恰當(dāng)?shù)臒岱�(wěn)定DNA聚合酶，這在該方案的討論部分會(huì)有進(jìn)一步的論述。 實(shí)驗(yàn)流程： 將1-10ug質(zhì)粒DNA溶于40ul H2O中，再加入10 ul 1M NaOH/1mM ETDA溶液。37℃孵育15 min 變性質(zhì)粒模板。 加入 5 ul 3 M NaAC，pH4.8.再加入150 ul預(yù)冷的乙醇沉淀DNA. 4℃ 離心10min 收集變性的質(zhì)粒DNA。小心棄去乙醇上清。再次乙醇沉淀，之后重新懸浮DNA于 20 ul水中。 配置一下體系 10× Reaction Buffer 5 ul 模板質(zhì)粒DNA 5-50ng Forward Primer(20 mM) 2.5 ul Reverse Primer (20 mM) 2.5 ul dNTP 2.5 ul Pfu 2.5 U 補(bǔ)水至 50 ul 5. 上PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。單堿基置換：12個(gè)循環(huán)，一個(gè)氨基酸置換：16個(gè)循環(huán)，插入或者缺失：18個(gè)循環(huán)。 6. 擴(kuò)增完成后電泳檢測(cè)。 7. 直接加入10 U Dpn I到5反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)，37℃ 反應(yīng)1h. 8. 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)。 9. 挑去數(shù)個(gè)菌落，培養(yǎng)管培養(yǎng)提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送一代測(cè)序，或者PCR擴(kuò)增送產(chǎn)物測(cè)序。 備注：以上為實(shí)驗(yàn)的大致步驟。MasterP根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行一定幅度的簡(jiǎn)化描述。但保留必要的步驟，仍可以作為實(shí)驗(yàn)參考。 關(guān)于1-3步驟：理論上，在質(zhì)粒DNA 用作PCR模板前不需要變性。如果省略堿變性步驟，超螺旋的天然雙鏈DNA也可以在PCR過程的加熱至94℃而變性。 堿變性的好處是：質(zhì)粒DNA在堿溶液中持續(xù)變性后會(huì)形成特定的狀態(tài)，這種形式的質(zhì)粒DNA可以作為模板，但是沒有再次轉(zhuǎn)化細(xì)菌的能力。因此，包含非變異的野生型DNA克隆的背景將明顯減少（Du et al,1995;Dorrell et al，1996）相對(duì)應(yīng)地，在聚合酶鏈反應(yīng)的變性步驟可打亂堿基配對(duì)，但并不會(huì)破壞質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)化的能力，因此轉(zhuǎn)化后的克隆含有比例較高的非變異的親本質(zhì)粒分子。在實(shí)驗(yàn)的最后階段，當(dāng)需要從克隆中篩選出含有突變的DNA時(shí)，堿變性的優(yōu)勢(shì)便會(huì)體現(xiàn)出來。 如果誘變效率低且所選的Dpn I無效，含有野生型分子的克隆比例可能會(huì)異常高。 關(guān)于10× Reaction Buffer:因?yàn)橐獢U(kuò)增一個(gè)完整的質(zhì)粒，長(zhǎng)度要比一般的PCR擴(kuò)增要長(zhǎng)，這要求反應(yīng)緩沖液要適應(yīng)長(zhǎng)片段擴(kuò)增，pH要高于普通PCR所用Buffer。 關(guān)于高保真DNA聚合酶：Pfu的保真度足夠，但如今市面上有更好，擴(kuò)增更快速的高保真DNA聚合酶可用。如果是購(gòu)買了定點(diǎn)突變?cè)噭┖�，使用配套的聚合酶就足夠了�?br /> 關(guān)于PCR循環(huán)次數(shù)：所有實(shí)驗(yàn)盡量不超過20個(gè)循環(huán)，這是為了保持較低的拷貝數(shù)，同時(shí)，PCR的后期（20個(gè)循環(huán)以后的循環(huán)內(nèi)）更容易產(chǎn)生突變，較少的循環(huán)數(shù)也有利于保真度，出現(xiàn)非預(yù)設(shè)突變的概率也較低。 關(guān)于誘變效率低的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：在步驟7前，需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酚氯仿抽提，乙醇沉淀。但是如今一般實(shí)驗(yàn)室較少使用酚氯仿這類試劑，實(shí)驗(yàn)室使用商品化的PCR產(chǎn)物純化試劑盒也能完成這一步的產(chǎn)物純化工作。隨后，進(jìn)行磷酸化，再用連接酶處理。這樣的操作是將帶nick的開環(huán)質(zhì)粒在分子內(nèi)而不是分子間環(huán)化，更有利于大腸桿菌轉(zhuǎn)化。 關(guān)于最終測(cè)序驗(yàn)證：測(cè)序驗(yàn)證不可少，這一步?jīng)]必要為節(jié)約測(cè)序費(fèi)用而省略。以Master P個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，挑去3-5個(gè)菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，測(cè)序就足夠挑到含目的突變點(diǎn)的突變質(zhì)粒了。 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備： 一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，大多能夠完成PCR/電泳/膠回收/轉(zhuǎn)化/細(xì)菌培養(yǎng)，所以對(duì)常規(guī)試劑與儀器將不再列表。 對(duì)于有錢的土豪，Master P自然要列出Bigger Than Bigger的試劑,全是大牌進(jìn)口：如Agilent 公司的Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit,New England Biolabs公司的Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit,ThermoFisher公司的Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit或者GeneArt Site-Directed Mutagenesis System等。這些試劑盒無疑都是比較優(yōu)秀的產(chǎn)品，使用起來方便，所需試劑如dNTP，Dpn I，感受態(tài)細(xì)胞，甚至SOC培養(yǎng)基都配備齊全。如下圖中QuickChange試劑盒的物品清單，便可見Master P所言不假。 圖2 QuickChange 突變?cè)噭┖薪M分清單（取自對(duì)應(yīng)產(chǎn)品說明書） 在此，Master P給出實(shí)驗(yàn)所需的高低配置，是不是很像組裝電腦配置單？ 土豪至尊版配置是這樣的： 中產(chǎn)舒適版配置是這樣的： 小康宜家版配置是這樣的： 溫飽掙扎（大神）版配置是這樣的： 關(guān)于各個(gè)版本說明： Master P發(fā)現(xiàn)，任何行業(yè)都存在省力氣（時(shí)間）費(fèi)錢這么個(gè)道理：比如點(diǎn)外賣比自己做飯貴，打車比步行去某地要貴，在網(wǎng)上花錢購(gòu)買資料貴比辛苦搜尋貴。可見時(shí)間就是金錢。人的財(cái)富是我們的時(shí)間和勞動(dòng)力，再次印證了亞當(dāng)斯密誠(chéng)不欺我也！ 使用試劑盒來完成實(shí)驗(yàn)固然輕松，但是也有其弊端。在Master P還是學(xué)生時(shí)期，就不太明白簡(jiǎn)單如質(zhì)粒提取試劑盒內(nèi)各個(gè)成分的作用，只知按照說明書無腦一頓操作就能提取到自己想要的質(zhì)粒。這弱化學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)原理的動(dòng)力與機(jī)會(huì)。 窮人的孩子早當(dāng)家，沒錢的實(shí)驗(yàn)室，做實(shí)驗(yàn)只能更多的DIY了：試劑都由自己純手共打造。 那么，為什么定點(diǎn)突變的乞丐（大神）僅僅用一個(gè)高保真DNA聚合酶，而不用Dpn I也能完成呢？ 原因就在Dpn I只是一個(gè)控制原始質(zhì)粒的手段，而非必不可少。 關(guān)鍵點(diǎn)在控制量：一是使用模板的量，雖然5ng的質(zhì)粒DNA是一個(gè)理想的模板濃度，但是低至0.1ng的模板DNA也是可以擴(kuò)增出來的；這就弱化了Dpn I消化的必要性。二是可以犧牲一點(diǎn)點(diǎn)保真度的考量，增加幾個(gè)循環(huán)以使擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)模板量比例更高一點(diǎn)。三是可以挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化子，按照概率算，只要前兩步關(guān)鍵點(diǎn)控制好，肯定得到至少一個(gè)正確突變點(diǎn)。這就足夠了，誰(shuí)讓我們窮吶！ 當(dāng)然，如果不嫌麻煩，提前對(duì)模板做個(gè)堿變性，也是能提高效率，降低背景的。 引物設(shè)計(jì)原則 一對(duì)寡核苷酸引物： 必須能與同一目標(biāo)序列互補(bǔ) 長(zhǎng)度必須相等（在25-45個(gè)堿基之間）；計(jì)算出的解鏈溫度為78℃或更高。Tm應(yīng)足夠高以防止錯(cuò)配，并且足夠低以便允許引物-引物二聚體在擴(kuò)增反應(yīng)的變性步驟解開。 應(yīng)終止在一個(gè)G或者C殘基 不需要磷酸化。 通常未經(jīng)純化便可使用。然而，如果使用快速液相色譜（FPLC）或聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）純化獲得引物進(jìn)行突變，尤其是產(chǎn)生插入和缺失突變時(shí)，效率會(huì)更高。 當(dāng)引入點(diǎn)突變時(shí)，一個(gè)引物帶有野生型序列，而另一條引物含有所需的突變，并且在突變位置的兩側(cè)都至少含有12個(gè)堿基的正確序列。如果產(chǎn)生缺失突變，兩個(gè)引物都含有野生型序列，但它們的間距在模板上的距離與缺失片段的長(zhǎng)度相關(guān)。產(chǎn)生插入突變的話，需要一個(gè)引物包含的野生型序列而另一個(gè)引物的5`端含有需要插入片段的序列。 這段關(guān)于分子克隆四版關(guān)于引物設(shè)計(jì)的原封抄寫，個(gè)人感覺有一半含混不清。不知道美國(guó)作者的錯(cuò)，還是軍科院研究生翻譯水平的偏差？話說整體來看，第四版中文版錯(cuò)誤的地方還真不少，很多翻譯的原因，難道真如Master P的導(dǎo)師所針砭的，90年代的研究生，00年代的研究生和10年代的研究生，一代不如一代？ 不能太教條，盡信書不如無書，即使是分子生物學(xué)中的Bible級(jí)別的工具書。事實(shí)上，任何人也都不可能在所有方面成為專家。且不說一代不如一代這樣的問題，現(xiàn)在讀研的學(xué)生越來越多，大有“人均研究生”的趨勢(shì)，那么治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯可急壤�，究竟是低了�?br /> 即便是Agilent公司，也沒有徹底修改自己的引物設(shè)計(jì)原則。Lei Zheng等（2004）報(bào)道了一種部分重疊的突變引物設(shè)計(jì)原則，效果不錯(cuò)。QuickChange有一版說明書引用了這篇，但是仍沒有作為主流方法。 圖3 Partial Overlapping 引物設(shè)計(jì)方法示意圖 與標(biāo)準(zhǔn)QuickChange 設(shè)計(jì)方法相比，兩對(duì)引物非完全互補(bǔ)的Partial Overlapping設(shè)計(jì)方法有以下幾個(gè)好處： Tm不再是不得不考慮的因素，更廣泛的堿基序列可被用到序列設(shè)計(jì)區(qū)域 可以跨越更寬的序列區(qū)域。 突變位點(diǎn)可離5`端4bp，離3`端6-8bp,而標(biāo)準(zhǔn)QC設(shè)計(jì)是要放在離兩端10-15bp的中間。 一條引物可包含更多突變堿基，最高達(dá)17.5%的突變堿基占比，這一特點(diǎn)對(duì)需要考慮中性突變的應(yīng)用更加有用。 Overlapping設(shè)計(jì)的一些原則： 3`端非重疊區(qū)域包含至少8bp 目標(biāo)突變點(diǎn)序列應(yīng)包含在上下游序列內(nèi)，中性突變應(yīng)至少包含在一條引物內(nèi)。 引物末端至少1個(gè)G或者C堿基。 也許，從善如流真的很難做到。有需求的可以下載此篇看看，NAR的文章基本都是免費(fèi)的。 圖4 Lei Zheng關(guān)于定點(diǎn)突變的文獻(xiàn) 聚合酶酶選擇： 應(yīng)滿足三個(gè)基本需求：1.校對(duì)活性高；2.堿基錯(cuò)配率低；3.缺乏非模板末端轉(zhuǎn)移酶活性 MasterP發(fā)現(xiàn)，中文的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》確實(shí)不能深究，以上3個(gè)特點(diǎn)讓人迷惑，校對(duì)活性是保真度所依賴的活性，而保真度高自然錯(cuò)配率低，所以1和2嚴(yán)格來說就是一個(gè)特點(diǎn)呀！第三點(diǎn)就是不依賴模板的末端轉(zhuǎn)移酶（Terminal transferase，TdT）活性，翻譯為“非模板末端轉(zhuǎn)移酶活性”是不妥的，這個(gè)研究生應(yīng)該出來挨打。當(dāng)然還有別的例子，翻譯人員理解程度，或者嚴(yán)謹(jǐn)性決定了翻譯質(zhì)量。 MasterP一言以蔽之：不要用Taq DNA聚合酶，選一個(gè)能擴(kuò)增長(zhǎng)片段的高保真DNA聚合酶就完事了！ 引物設(shè)計(jì)實(shí)例： 需要定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)，大多數(shù)是氨基酸定點(diǎn)突變，還有一些是基因調(diào)控序列（UP element,啟動(dòng)子序列，或者轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域）的突變研究。 盡管生物學(xué)發(fā)展到9102年了，但是蛋白質(zhì)單點(diǎn)氨基酸突變還是研究某個(gè)點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)整體折疊與穩(wěn)定性或活性關(guān)鍵位點(diǎn)的有用方法，即使知道了野生型酶的三維結(jié)構(gòu)，仍無法準(zhǔn)確回答某位點(diǎn)的改變對(duì)酶整體的影響變化。 一個(gè)突出的典型的例子是Tabor和Richardson（1990）對(duì)T7 DNA聚合酶活性位點(diǎn)的研究，這一成果帶來了用于熱循環(huán)測(cè)序所用的Taq DNA聚合酶開發(fā)。 下面Master P將列出兩張圖以揭示兩種不同引物設(shè)計(jì)的直觀差別 圖5 經(jīng)典的QuickChange定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì) 圖6 Overlapping定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì) 個(gè)人傾向于第二種設(shè)計(jì)方式，因?yàn)樯舷掠我锊粫?huì)完全互補(bǔ)，退火受到影響更小，如果感興趣可以結(jié)合引物設(shè)計(jì)的基本理論在腦海里模擬這個(gè)退火延伸的過程。 以上是關(guān)于以環(huán)形質(zhì)粒做定點(diǎn)突變方法的主要內(nèi)容。希望能給初學(xué)者帶來指導(dǎo)性的方法，也希望能為行業(yè)老兵帶來新的思考角度�？上�(gè)人訂閱號(hào)關(guān)注者還太少，離可開通評(píng)論功能還差的有點(diǎn)遠(yuǎn)。Master P還會(huì)努力的。 2019-4-29 利益沖突聲明 Master P就職于北京某生物科技公司研發(fā)崗。本文涉及的產(chǎn)品及相關(guān)評(píng)價(jià)均來自參考資料或本人實(shí)際經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，如涉及侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系刪除，本人不對(duì)以上所有產(chǎn)品或服務(wù)作任何目的性、傾向性引導(dǎo)，因此，Master P不對(duì)以上產(chǎn)品或服務(wù)的實(shí)際使用效果承擔(dān)任何責(zé)任！ 2019-4-29 參考文獻(xiàn) 1.M.R.格林，J.薩姆布魯克.體外誘變方法，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》第四版中文版，2017，科學(xué)出版社 2.Vovis GF，et al.Complementary action fo restriction enzymes endo R-Dpn I and R-DpnII on bacteriophage f1 DNA.J Mol Biol 115:525-538 3.Weiner,M P，et al.Site-directed mutagenesis of double-stranded DNA by thepolymerase chain reaction.Gene 151:119-123 4.Du Z，et al.Improved recombinant PCR mutagenesis procedure that usesalkaline-denatured plasmid template.Biotechniques 18:376-378 5.Dorrell N,et al.Improved efficiency of inverse PCRmutagenesis.Biotechniques 21：604-608 6. QuikChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit Instruction manual,Version E.0，Agilent 7.Lei Z,et al. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesisprotocol.Nucleic Acid Research,2004,32:e115 https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MzkwMDkzNw==&mid=2247483670&idx=1&sn=0c41f53854060efa0161dca05a6f55bb&chksm=fd3bd0f0ca4c59e6dfec34fe31a776cf775f3959ab29e58ab5b6f503b8bad82d2783d7889e91&token=73890196&lang=zh_CN#rd |
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禁蟲 (小有名氣)
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21樓2019-10-11 10:30:43
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2019-05-21 00:37
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2019-05-21 08:49
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擼鐵擼科研8樓
2019-05-21 08:56
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擼鐵擼科研13樓
2019-05-24 11:31
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