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土壤DNA提取純化的最佳方法 已有1人參與
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簡介 土壤宏基因組學(xué)技術(shù)是近來發(fā)展比較迅速的一種新方法，是研究土壤微生物生態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)，也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。宏基因組學(xué)又叫環(huán)境基因組學(xué)（Environmental Genomics）或群體基因組學(xué)（Community Genomics），定義為利用現(xiàn)代基因組技術(shù)直接研究自然狀態(tài)環(huán)境中的有機(jī)體群落，而不需要分離、培養(yǎng)單一種類的微生物。研究環(huán)境基因?qū)W的前提就是要獲得質(zhì)量足夠好的DNA，由于土壤微生物往往會與土壤其他組分緊密結(jié)合，這就增加了提取土壤DNA的難度。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，使其釋放DNA，繼而抽提純化；間接提取法是首先去除土壤等雜質(zhì)，通過不同的離心速度從土壤中分離出細(xì)胞，然后對細(xì)胞進(jìn)行抽提。直接提取法提取的DN**段較小（1~50kb），提取率高，操作簡單；間接提取法提取的片斷較大（20~500kb），純度高，但操作繁瑣，有些微生物在分離過程中會丟失得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組)，目前已經(jīng)很少研究者會采用這種方法。 直接法純化土壤DNA最大的難點是如果有效除去與核酸分子非常相似的腐殖酸，因為痕量的腐殖酸的存在對后續(xù)的實驗影響嚴(yán)重，比如PCR失敗等。傳統(tǒng)的純化方法幾乎不能有效除去腐殖酸，GBCBIO Technologies公司經(jīng)過技術(shù)公關(guān)，在如何有效除去腐殖酸等抑制因子上取得重大突破，研發(fā)出高效的腐殖酸吸附劑，能夠徹底除去腐殖酸等抑制因子，腐殖酸吸附劑是添加在裂解的過程中，后續(xù)的純化采用硅膠柱的方式，因而操作上更簡單，無繁瑣的操作。GBCBIO公司的土壤DNA提取試劑盒能與進(jìn)口MOBIO公司的相媲美。 實驗流程： 1. 稱0.3-0.5g土壤置于2ml離心管中，加入0.4g Glass Beads，再加入780μl Buffer C1與100μl Buffer C2。渦旋器高速震蕩3-5min。 注意：Buffer C2是我司獨特的腐殖酸除去劑，100μl對大部分樣品來說足以有效除去腐殖酸等抑制因子。對一些腐殖酸含量特別豐富的土壤， Buffer C2的量可以適當(dāng)增加，但不能超過250μl，否則會嚴(yán)重影響DNA的得率。 2. 加入100μl Buffer C3（C3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），渦旋混勻。70℃水浴處理10min。期間振蕩幾次。 注意：如果要純化革蘭氏陽性菌的DNA，請在70℃處理完后，再90℃水浴處理2min。 3. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘，轉(zhuǎn)650μl上清到1.5ml離心管中，加入150μl BufferC4混勻。 4. 冰上放置5min。12000 rpm(~13000×g)離心1鐘。 5. 轉(zhuǎn)移上清到新的2ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇，顛倒混勻，12000 rpm(~13000×g)離心2鐘。 注意：如果是DNA含量很低的土壤樣品，建議離心前-20℃放置1小時。 6.倒掉上清，倒置離心管于吸水紙上30-60秒。加入100μl滅菌去離子水，再加入350μl Buffer C5（必須把Buffer C5混勻后再吸�。�，渦旋混勻，70℃水浴放置數(shù)分鐘，至沉淀完全溶解即可。 7. 12000 rpm(~13000×g)離心1鐘，400μl轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離心管中，加入150μl無水乙醇，混勻。 8. 將上一步所得溶液加入到GBC吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30秒，倒掉濾過液重新套回收集管。 9. 向GBC吸附柱中加入500 μl Buffer WB，12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。 10. 向GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30 秒，倒掉廢液，GBC吸附柱放入收集管中。 11. 向GBC吸附柱 中加入650 μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,000×g ) 離心30秒，倒掉廢液，將GBC吸附柱放入收集管中。 12. 12,000 rpm(~13,000×g)離心2 分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 13. 將GBC吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100 μl 洗脫緩沖液TE或滅菌去離子水，室溫放置2-5 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g ) 離心2 分鐘，將溶液收集到離心管中。 注意：為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2 分鐘，12,000 rpm(~13,400×g )離心2 分鐘。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(nèi)(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH 值低于7.0 會降低洗脫效率；且DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA 降解。 詳見如下網(wǎng)頁： 土壤DNA提取純化的最佳方法  |
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2樓2019-04-15 13:01:07
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