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keyuandi新蟲 (初入文壇)
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[交流]
活體生物發(fā)光成像技術(shù)標(biāo)記原理
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哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。基因、細(xì)胞和活體動物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。將標(biāo)記好的細(xì)胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素D-Luciferin Firefly, potassium salt（Sciencelight, Catalog# luc001） ，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。 除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素D-Luciferin Firefly, potassium salt（Sciencelight, Catalog# luc001） ，后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540~600nm，后者所發(fā)的光波長在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標(biāo)記，也可采用后者作為備選方案。 熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 對于細(xì)菌標(biāo)記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標(biāo)記的細(xì)菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細(xì)菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細(xì)菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達。 |
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