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JM109新蟲 (初入文壇)
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[交流]
雙質(zhì)粒系統(tǒng)的knock-in載體donorDNA區(qū)構(gòu)建 已有2人參與
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有沒有經(jīng)常做酶切連接的大神來看一看。 knockout和knockin兩個載體同時在構(gòu)建。 knockout是將目的基因上下游同源臂A,B通過overlap pcr連在一起，然后酶切連接到載體上。 knockin是在上述基礎(chǔ)上在上下游同源臂A,B之間再加入一段有功能的基因，是3個片段的overlap pcr產(chǎn)物。 然而，兩個片段的很容易就連上載體了，但是加入一段基因后，-同源臂A-基因-同源臂B- 這個片段死活連不上載體，很頭疼不知道哪里出了問題。 out和in兩端保護堿基都是一樣的，連接的載體骨架也是一樣的，酶切位點都是EcoR1和Hind3，片段雙酶切過夜完膠回收然后再跑電泳條帶都是大小正確且單一的。然后t4 16度連4h轉(zhuǎn)化感受態(tài)。轉(zhuǎn)化平板一般都不長或者長得慢挑出來驗證都不是。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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新蟲 (初入文壇)
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2樓2019-05-22 23:34:07
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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首先，我很想知道你三個片段overlap產(chǎn)物怎么來的??問題可能就出在這里啦，你想啊，正反一對引物，恰好可以結(jié)合起來還有倆粘性末端，那三個正反正?但是你首尾是反的��！所以要至少四條，正反正反才可以實現(xiàn)。不然你的三條產(chǎn)物就只有正反，最后一個還是反的結(jié)合不了，也就沒有合適的粘性末端啦。當(dāng)然也不會成功。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2019-05-30 16:46:08
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