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請(qǐng)教：熒光定量PCR相關(guān)問(wèn)題 已有1人參與
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大家小年好！給各位蟲(chóng)友拜個(gè)早年呀，本人年后要做qPCR實(shí)驗(yàn)，老師要求在假期寫(xiě)好實(shí)驗(yàn)方案，查閱了RT-qPCR相關(guān)資料，仍有一些問(wèn)題不太清楚，希望大家?guī)兔獯鹨幌隆?br />
首先我做這個(gè)實(shí)驗(yàn)是為了確定該基因在兩種不同條件下的表達(dá)量，所以選擇相對(duì)定量的方法，實(shí)驗(yàn)步驟分為提取RNA、反轉(zhuǎn)錄制備cDNA、以cDNA為模板定量PCR三塊，我的問(wèn)題是：1 參照基因怎么選擇，好像有GAPDH和actin（我知道的是這兩種），但是這兩個(gè)基因存在于我的實(shí)驗(yàn)菌株Sphingomonas sp嗎？如果存在的話(huà)我是否需要逐個(gè)確定參照基因的表達(dá)量是穩(wěn)定的，選出最合適的內(nèi)參基因 2 反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA是單鏈嗎？是否需要以cDNA為模板合成互補(bǔ)鏈？為什么 3 反轉(zhuǎn)錄之后獲得的應(yīng)該是cDNA 池吧，因?yàn)镽NA有三種啊，在不知道模板序列的情況下怎么設(shè)計(jì)目標(biāo)基因的引物？ 4 參照基因的引物怎么設(shè)計(jì) 5 在測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣本的目標(biāo)基因和參照基因的Ct值時(shí)，起始RNA的量是否應(yīng)該一致，做對(duì)照樣本的實(shí)驗(yàn)時(shí)，RNA的量是否應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)組調(diào)整成相同 |
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junjieshao
禁蟲(chóng) (小有名氣)
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7樓2019-04-27 04:28:04
我欲乘風(fēng)歸去
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西門(mén)吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-01-30 08:47:40
西門(mén)吹雪170: 金幣+4, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-01-30 08:47:40
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1 參照基因怎么選擇，可以參考文獻(xiàn)，百度文獻(xiàn)或者知網(wǎng) 搜索 phingomonas sp（中文名）+定量PCR 有些文獻(xiàn)會(huì)給你內(nèi)參基因的引物序列，直接合成即可。 2 cDNA是雙鏈。 3. 反轉(zhuǎn)錄獲得的是cDNA池。如果你不知道目標(biāo)基因的模板序列，只能祈求能在文獻(xiàn)里找，看有沒(méi)有人在別的菌種里做過(guò)這個(gè)目標(biāo)基因，找到這個(gè)其他菌種里基因的序列，在NCBI上比對(duì)，看能否找到在 phingomonas sp的這個(gè)基因序列，再設(shè)計(jì)引物了。 5 起始的RNA量最好都調(diào)成一致。包括對(duì)照樣本和基因樣本。 |
2樓2019-01-29 23:10:50
3樓2019-01-30 10:46:30
我欲乘風(fēng)歸去
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糾正一下：一般進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄時(shí)合成的僅為單鏈的DNA，但是足夠引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)，在一個(gè)循環(huán)以后正義反義兩條鏈均存在于體系內(nèi)。雙鏈DNA在變性之后也成為單鏈DNA，擴(kuò)增時(shí)的效率和動(dòng)力學(xué)與單鏈DNA差別不大。 關(guān)于第三點(diǎn)，cDNA序列是沒(méi)有內(nèi)含子的，如果你做的是原核生物是沒(méi)有內(nèi)含子的，也就是DNA序列就是cDNA序列。真核生物是有內(nèi)含子的，cDNA序列和DNA序列是不同的。 |
4樓2019-01-30 14:49:14
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