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原味熒光雜交（FISH）細(xì)節(jié)求教 已有1人參與
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rt，樓主現(xiàn)在正在做FISH實驗遇到了幾個問題，想請教下各位同行。問題如下： 1. 原位雜交一般是有個帶熒光的探針和DAPI復(fù)染，那請問在激光共聚焦上看的時候是選擇熒光探針的激發(fā)和發(fā)射波長，還是說要包括DAPI的激發(fā)和發(fā)射波長，從而進(jìn)行圖片疊加呢？ 2. 像我們實驗室激發(fā)波長最低是488nm，明顯超過DAPI的340nm上限，那為什么我還能在激光共聚焦上看到有藍(lán)色的部分？ 3. 用DAPI復(fù)染的目的是什么？是為了觀察其他沒攜帶探針的微生物嗎？如果是，那可否不進(jìn)行復(fù)染呢？ |
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Davidzjy
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【答案】應(yīng)助回帖
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從原理的角度講 FISH的探針通常標(biāo)記一個比較小的片段 這種熒光信號太小 在低倍鏡下很難找 DAPI這類復(fù)染劑的作用就是顯示細(xì)胞核位置的 你看復(fù)染劑的英文counterstain 其中前綴counter-表示“相反的” stain表示“染色;染料” 一般的顯微操作流程 也是先在低倍鏡下用DAPI找到細(xì)胞對好焦 然后切到高倍鏡 定下視野再切換到探針對應(yīng)的通道來觀察信號 至于最后一個問題 個人理解LZ的意思是問為什么肉眼能看到藍(lán)光打在玻片上——因為DAPI的激發(fā)光屬于紫外線范圍 而濾光片會保留光譜上與激發(fā)光相近波長的光線 因此在光譜上與紫外線相鄰的可見光（藍(lán)紫色光）就被漏過了 一個類似的例子 實驗室、醫(yī)院里常用的紫外消毒燈在工作時 肉眼看也是發(fā)藍(lán)紫色光 |
4樓2023-01-24 12:36:05
恒意賽teh 
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2樓2023-01-15 15:08:41
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3樓2023-01-15 15:10:11
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十分感謝您的回復(fù)。另外我還有個小問題想再請教下：就是我下面A圖是雜交的情況，而C圖是無義雜交（沒雜交的），就是我不太明白這兩個有什么差別？明明都有染色，只是一個有亮點，一個沒有，但這樣會影響我們找到目標(biāo)微生物嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2023-01-28 19:25:38
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