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江湖救急 已有2人參與
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誒，慚愧。這個(gè)PCR折磨了我一個(gè)多月了。剛開始部分能p出來，幾個(gè)挑單克隆測序不對，測序出來了3個(gè)，后面再做pcr怎么p都不出來了，用什么酶都試了一遍，退火條件也試過了，都跑不出來。用基因組DNA也不行，跑出來幾個(gè)，純化后連接轉(zhuǎn)化挑不出陽性。PCR卡就算了，好幾個(gè)還都卡在陽性挑不出來，好郁悶啊，后面覺得是引物可能設(shè)的不好，所以重設(shè)了引物，但是也就提高了退火，降低了上下游的差異在差中選優(yōu)，還是沒有擴(kuò)增出來。想問問有沒有有經(jīng)驗(yàn)的，想請教一下，是模板的問題嗎？RNA打算重新提一下。陽性挑不出來又該怎么調(diào)整呢，用的是重組連接酶，和這個(gè)有關(guān)系嗎？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-10-31 22:48:05
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西門吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2019-10-31 22:48:05
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首先 你這是提什么的rna rna跑膠情況圖有嗎 引物是根據(jù)什么來設(shè)計(jì)的 推薦pcr溫度多少 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2019-10-31 00:29:30
2樓2019-10-30 20:53:05
3樓2019-10-30 23:05:33
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提的水稻的RNA有兩條帶，第三條帶看不到。是不是不太好，濃度在1300ng左右，引物是按照infusion的要求設(shè)的除了酶切位點(diǎn)有15個(gè)堿基的模板匹配，剩余分別基因的cds兩端，推薦的退火在60℃左右 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2019-10-31 11:47:23
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