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supergrape金蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于使用自殺質(zhì)粒pK18SacB進(jìn)行敲除受體菌基因組上的相關(guān)片段 已有2人參與
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| RT，我在前期將pK18SacB進(jìn)行改造，把卡那霉素基因替換為氯霉素（受體菌帶有卡那霉素抗性），左右同源臂的長(zhǎng)度大小是在500bp左右，構(gòu)建好的自殺載體pK18SacB是利用大腸桿菌S17進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，將濾膜上的菌體洗脫后涂到含有卡那霉素和氯霉素的培養(yǎng)基上。雙抗板上確實(shí)長(zhǎng)出疑似單交換的菌株（受體菌是假單胞菌，菌落形態(tài)與大腸桿菌不一樣，很容易分辨），同時(shí)涂到雙抗板上的受體菌沒(méi)有長(zhǎng)。問(wèn)題是，當(dāng)我用左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果只有一左同源臂+右同源臂的目的條帶，沒(méi)有左同源臂+敲除片段+右同源臂的目的條帶（PCR延伸時(shí)間是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置的）。隨后，我設(shè)計(jì)了基因組上左同源臂的上游引物+自殺質(zhì)粒中右同源臂下游引物進(jìn)行pcr，結(jié)果沒(méi)有相關(guān)目的條帶（PCR延伸時(shí)間是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂+300 bp的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置的）。懇請(qǐng)大佬解釋一下，雙抗板上的菌株是單交換的菌株嗎？ |
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supergrape: 金幣+100, ★有幫助 2020-01-12 20:21:20
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| 左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物 PCR 產(chǎn)物送測(cè)序，如果是你設(shè)計(jì)的同源臂，那應(yīng)該是成功的 |
supergrape3樓2020-01-02 19:54:08
2樓2020-01-01 21:13:28
supergrape
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4樓2020-01-02 23:05:54
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5樓2020-01-02 23:09:35
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