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小小書蟲飛新蟲 (小有名氣)
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一種細(xì)胞支原體污染快檢方法介紹 已有1人參與
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作為一個(gè)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)科研狗，最頭疼的莫過于細(xì)胞污染，真菌、細(xì)菌污染還好說操作得當(dāng)就可以避免，而且顯微鏡下容易觀察到，最惡心的要數(shù)支原體污染，污染之后細(xì)胞還能生長(zhǎng)，觀察不出什么異樣，但是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)往往無法重復(fù)，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 現(xiàn)在市場(chǎng)上有一些可以清除支原體的試劑，說實(shí)話我是不會(huì)用的，清除徹不徹底不說，對(duì)實(shí)驗(yàn)有啥影響也不好說。檢測(cè)到污染的細(xì)胞，一個(gè)字——扔。檢測(cè)支原體污染也是一道繁瑣的工序，試想每批細(xì)胞都得檢測(cè)一次，檢測(cè)一次花一天功夫。后來網(wǎng)上查到一種革命性的細(xì)胞污染支原體檢測(cè)試劑盒，每次檢測(cè)只需半個(gè)小時(shí)，給我減少了很多工作量，這么好用的東西當(dāng)然要分享安利一波。 這種支原體檢測(cè)試劑盒是由我國(guó)蘇州先達(dá)基因公司（www.gendx.cn）研發(fā)的，其原理是基于該公司自主開發(fā)的實(shí)時(shí)熒光恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對(duì)痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成，該試劑盒檢測(cè)范圍涵蓋130種支原體。 ERA核酸擴(kuò)增技術(shù)的核心是一套等溫核酸擴(kuò)增組合酶制劑。通過酶工程改造，將來源于細(xì)菌和病毒的特定工具酶進(jìn)行改造突變并篩選其功能，通過不同的DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化組合，從而獲得多種酶蛋白為核心的等溫?cái)U(kuò)增體系。配好的反應(yīng)體系在各種實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x或者該公司自主研發(fā)的簡(jiǎn)易恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀中，可實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)于一體，通過實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線在20min內(nèi)就可通過檢測(cè)儀的顯示屏讀出檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)過程無需開蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。ERA結(jié)合該公司提供的一步法提取DNA的試劑，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了支原體檢測(cè)操作，5min完成細(xì)胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測(cè)，整個(gè)過程只需30min。 細(xì)胞培養(yǎng)是生命科學(xué)研究、生物制藥、臨床細(xì)胞治療等領(lǐng)域最核心的環(huán)節(jié)，但是細(xì)胞在培養(yǎng)過程中極易受到污染，其中支原體污染是最普遍的污染源，污染細(xì)胞的平均比例為30-60%，有些國(guó)家甚至高達(dá)80-90%。支原體污染的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞變形、碎片增加、懸浮細(xì)胞容易成團(tuán)、培養(yǎng)基提前變色，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞實(shí)驗(yàn)無法重復(fù)，生物制藥中產(chǎn)品不合格，細(xì)胞治療效果失效甚至進(jìn)一步危害病人健康。 支原體是生物體中最小的無細(xì)胞壁的原核細(xì)胞，直徑約為0.2-0.3 um，可以通過常用的除菌濾膜(0.22-0.45um)，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)中很難避免支原體的污染，而且無法通過普通顯微鏡觀察到，由于無細(xì)胞壁普通的抗生素對(duì)它根本不起作用。 從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求涉及細(xì)胞培養(yǎng)的投稿文章，要求必須進(jìn)行支原體檢測(cè)，截止目前，大量的SCI期刊都跟進(jìn)這項(xiàng)要求。為了提高動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物制品的質(zhì)量和安全性，中華人民共和國(guó)藥典規(guī)定主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批、對(duì)照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行支原體檢測(cè)。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定，應(yīng)該用合適的方法檢測(cè)細(xì)胞的支原體污染狀況。歐洲藥典規(guī)定對(duì)細(xì)胞治療產(chǎn)品需要進(jìn)行嚴(yán)格的支原體檢測(cè)。 以上這些要求和規(guī)定，再加上支原體的特性和污染的后果都指向一點(diǎn)——支原體分子檢測(cè)成為細(xì)胞培養(yǎng)必不可少的環(huán)節(jié)。 到目前為止，出現(xiàn)了各種各樣的支原體檢測(cè)方法，包括培養(yǎng)法，DNA熒光染色法，電子顯微鏡法、相差顯微鏡檢測(cè)法、3-H胸腺嘧啶摻入法、ELISA法、PCR（qPCR）法等等，但是這些方法或是因?yàn)槊舾行圆钊菀壮霈F(xiàn)假陰性結(jié)果，或是因?yàn)闄z測(cè)范圍小不能檢測(cè)到所有的支原體污染，或是因?yàn)樵囼?yàn)周期長(zhǎng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。如今先達(dá)基因研發(fā)的基于其ERA技術(shù)的支原體檢測(cè)試劑盒可以克服以上提到的所有問題，使支原體檢測(cè)如此簡(jiǎn)單準(zhǔn)確。  |
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