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有一個(gè)基因缺失型工程菌，需要轉(zhuǎn)入外源基因表達(dá)，想問下，質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)進(jìn)去的菌株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后是不是就會(huì)持續(xù)表達(dá)。后面幾次培養(yǎng)不加誘導(dǎo)劑是不是也會(huì)生長？

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1樓 2020-07-10 10:58:36

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4樓2020-07-11 07:33:35

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神農(nóng)使者: 金幣+5, ★★★很有幫助 2020-07-12 01:27:53

引用回帖:

3樓: Originally posted by 神農(nóng)使者 at 2020-07-10 15:10:04
謝謝回復(fù)。我這邊就是質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)去后，需要加阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，然后菌種可以生長，正常不加的話，基因不表達(dá)，菌種是不生長的。剛轉(zhuǎn)進(jìn)去后，是只有加了誘導(dǎo)劑后才生長，可后面培養(yǎng)了幾次發(fā)現(xiàn)不加阿拉伯糖也能生長。 ...

阿拉伯糖啟動(dòng)子的滲漏相對(duì)已經(jīng)很低了，滲漏是否足以支持菌株生長，試一下就知道。另外，你后面培養(yǎng)不誘導(dǎo)也能生長可能是你誘導(dǎo)的那個(gè)蛋白半衰期較長，已經(jīng)表達(dá)的蛋白還能存在很長時(shí)間，如果是這種情況，某些情況下會(huì)考慮在該蛋白后面加上降解標(biāo)簽。這都是我個(gè)人見解，僅供參考。

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5樓2020-07-11 08:43:15

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神農(nóng)使者: 金幣+5, ★★★很有幫助 2020-07-10 21:52:20

不是這樣的，我不太清楚你后幾次培養(yǎng)是什么操作，轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)基或者新的平板還是要加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑不會(huì)隨著菌株永遠(yuǎn)存在的，何況誘導(dǎo)劑和調(diào)控蛋白的結(jié)合與解離本就是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

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2樓2020-07-10 14:34:10

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2樓: Originally posted by 雨獨(dú)步 at 2020-07-10 00:34:10
不是這樣的，我不太清楚你后幾次培養(yǎng)是什么操作，轉(zhuǎn)接新的培養(yǎng)基或者新的平板還是要加誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑不會(huì)隨著菌株永遠(yuǎn)存在的，何況誘導(dǎo)劑和調(diào)控蛋白的結(jié)合與解離本就是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。

謝謝回復(fù)。我這邊就是質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)去后，需要加阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，然后菌種可以生長，正常不加的話，基因不表達(dá)，菌種是不生長的。剛轉(zhuǎn)進(jìn)去后，是只有加了誘導(dǎo)劑后才生長，可后面培養(yǎng)了幾次發(fā)現(xiàn)不加阿拉伯糖也能生長。就是疑問是不是在誘導(dǎo)劑的板子上經(jīng)誘導(dǎo)后就能持續(xù)表達(dá)了。問過一個(gè)師兄，他說這種情況是提前誘導(dǎo)了，需要讓誘導(dǎo)消失，才能重新進(jìn)行后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，否則實(shí)驗(yàn)不準(zhǔn)確。就是不清楚怎么才能讓給誘導(dǎo)消失，還是最好重新轉(zhuǎn)化一次。

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3樓2020-07-10 15:10:04

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5樓: Originally posted by 雨獨(dú)步 at 2020-07-10 18:43:15
阿拉伯糖啟動(dòng)子的滲漏相對(duì)已經(jīng)很低了，滲漏是否足以支持菌株生長，試一下就知道。另外，你后面培養(yǎng)不誘導(dǎo)也能生長可能是你誘導(dǎo)的那個(gè)蛋白半衰期較長，已經(jīng)表達(dá)的蛋白還能存在很長時(shí)間，如果是這種情況，某些情況下 ...

謝謝�，F(xiàn)在只想知道這個(gè)重組菌是不是沒用了，因?yàn)楹竺嬉龅氖堑鞍卓剐院Y選，這種持續(xù)表達(dá)不是很難做后續(xù)了嗎。還有想請(qǐng)問下降解標(biāo)簽一般有哪些。

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6樓2020-07-12 01:29:38

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4樓: Originally posted by forhighbio at 2020-07-10 17:33:35
啟動(dòng)子是阿拉伯糖操縱子，調(diào)控不嚴(yán)格，有滲漏表達(dá)

我也感覺是有本底表達(dá)，而且表達(dá)量還挺高，現(xiàn)在我這個(gè)重組菌在純amp的板子上長的跟加了阿拉伯糖生長差不多了。理論上純amp的板子應(yīng)該是不長的，現(xiàn)在有點(diǎn)慌，不知道該怎么弄了。

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7樓2020-07-12 02:20:38

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6樓: Originally posted by 神農(nóng)使者 at 2020-07-12 01:29:38
謝謝�，F(xiàn)在只想知道這個(gè)重組菌是不是沒用了，因?yàn)楹竺嬉龅氖堑鞍卓剐院Y選，這種持續(xù)表達(dá)不是很難做后續(xù)了嗎。還有想請(qǐng)問下降解標(biāo)簽一般有哪些。...

大腸桿菌中常用的降解標(biāo)簽有LAA和ssrA，也有研究者對(duì)這些tag的氨基酸進(jìn)行不同程度改變，衍生出一系列降解特性各有差異的tag。

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8樓2020-07-12 09:06:18

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另外你缺陷的這個(gè)基因是不是不是致死突變。

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9樓2020-07-12 10:11:43

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9樓: Originally posted by forhighbio at 2020-07-11 20:11:43
另外你缺陷的這個(gè)基因是不是不是致死突變。

我這個(gè)工程菌缺失的基因是代謝酶基因，這個(gè)菌株是在普通LB板子上不生長，正常培養(yǎng)需要額外添加外源蛋白�，F(xiàn)在我是在做同源基因的原核表達(dá)，一是看目的基因表達(dá)后能否在正常板子上生長，再一看是看表達(dá)量�，F(xiàn)在轉(zhuǎn)化后能生長，但是表達(dá)量有點(diǎn)控制不住，感覺實(shí)驗(yàn)出問題了

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10樓2020-07-12 13:06:22

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