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抗腫瘤活性的新型高效細胞穿膜肽[Cys-CPT2,9 ] penetratin 的設計及活性評價
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摘要: 本文將半胱氨酸-喜樹堿 (Cys-camptothecin, Cys-CPT) 引進 penetratin第2、9位, 合成新型穿膜肽類似物 [Cys-CPT2,9] penetratin, 旨在探索一條具有強穿膜活性且具有抗腫瘤活性的新型細胞穿膜肽。通過激光共聚焦實驗和流式細胞術觀察 [Cys-CPT2,9] penetratin在HeLa 細胞中熒光攝取情況, 使用不同內吞抑制劑研究 [Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取機制, 最后通過MTT實驗測試[Cys-CPT2,9]penetratin 抗腫瘤活性。在激光共聚焦及流式細胞術實驗中顯示 [Cys-CPT2,9] penetratin 的穿膜活性顯著增強, 它的胞內熒光強度比 penetratin 明顯提高5倍。而對于 [Cys-CPT2,9] penetratin的細胞攝取機制, 它主要通過網格蛋白和巨胞飲內吞途徑進入細胞內。[Cys-CPT2,9] penetratin 對HeLa細胞具有抗腫瘤活性, 并強于抗腫瘤藥物喜樹堿，結果說明, [Cys-CPT2,9] penetratin 是一個新的高膜轉導活性的細胞穿膜肽, 同時對HeLa細胞具有抗腫瘤活性。 在正常的人類生命活動中, 基因的選擇性剪切會表達不同功能的蛋白分子來參與人體正常的生理代謝過程 。當基因的剪切出現(xiàn)紊亂時, 會產生異常 的表達產物, 它們可能會影響正常的生理過程, 甚至導致疾病的發(fā)生[1, 2] 。目前全世界每年有大約700~ 1 000 萬人死于癌癥,因此癌癥是一個巨大的醫(yī)學挑戰(zhàn)[3, 4] 。而它的產生和發(fā)展與許多癌癥相關基因 BCL-X、MDM2和FGFR1等過表達密切關聯(lián)[5, 6]。在癌癥治療中, 許多化療藥物和幾乎全部生物大分子藥物由于難以透過細胞膜限制了抗腫瘤作用的發(fā)揮。因此, 發(fā)展促使這些藥物被細胞攝取的策略變得尤為重要[7]。 細胞穿膜肽 (CPPs) 作為一種由 5～30氨基酸組成的短肽, 是非常有潛力的藥物遞送載體之一[8] 。它能夠遞送各種大分子藥物穿透細胞膜進入細胞內且不影響它們的生物活性[9−11]。因此, 作者希望以CPPs作為模板設計出高效的非病毒載體。Penetratin來源于果蠅觸角蛋白同源結構域, 是一條兩親性的穿膜肽; 因為它具有較好的穿膜效應被作為一個潛在藥物載體用于各種目的[12−14]。Penetratin序列中的陽離子氨基酸精氨酸 (Arg) 和賴氨酸 (Lys) 是發(fā)揮穿膜活性的不可替代的位點, 如果對它們進行替換或改造會降低穿膜效應[15] 。而序列中的色氨酸 (Trp) 、苯丙氨酸 (Phe) 和異亮氨酸 (Ile) 為疏水性氨基酸, 可以促進肽與細胞膜脂質的相互作用[16−18] 。因此, penetratin具有穿膜特性和兩親性, 使它可作為設計新型非病毒載體的潛在模板。 在本研究中, 以 penetratin作為設計的母肽, 將它的2位和9位的氨基酸替換為半胱氨酸−喜樹堿(Cys-camptothecin, Cys-CPT)以增加 penetratin的兩親性, 旨在提高其穿膜效率的同時也使它具有一定的抗腫瘤效應, 最后得到了肽[Cys-CPT2,9] penetratin (圖 1), 作為新型載體用于腫瘤基因治療。 圖片 材料與方法 實驗材料與儀器 RPMI- 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 購自Gibco公司; 新生牛血清 (newborn bovine serums, NBS) 購自杭州四季青生物工程材料有限公司; 噻唑藍[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT]、 頭孢哌酮 (cefoperazone, CPZ) 、 異 丙基 阿米洛利 [5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride, EIPA] 、 甲基-β-環(huán) 糊精 (methyl-beta-cyclodextrin, MβCD) 和 CPT 均購 自 Sigma-Aldrich 公司; 異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 購自蘇州亞科化學試劑有限公 司。全自動酶標儀 (Bio-Rad 公司); 激光共聚焦顯微鏡 (Zessie 公司); 流式細胞儀 (Becton Dickinson 公司)。 Penetratin 和[Cys-CPT2,9] penetratin 肽的合成 選擇的方法為采用經典的多肽固相合成法合成。采 用 MBHA 樹脂 (取代值為 0.54 mmol · g− 1) 合成, 表 1 中所述肽序列。其中熒光素 FITC 通過連接子六氨基己酸 (6-aminocaproic acid, AHX) 連接在肽鏈的氮末端, 而[Cys-CPT2,9] penetratin 的合成是在主鏈[Cys2,9] penetratin 的合成后, 通過二硫鍵連接反應將CPT偶 聯(lián)到[Cys2,9] penetratin 的第 2、9 位半胱氨酸的側鏈巰 基基團上。最后經 RP-HPLC 純化和 ESI-MS 質譜鑒定后的目標肽[19], 用于后續(xù)實驗。 圖片 細胞培養(yǎng) HeLa 細胞 (人宮頸癌細胞, 上海中國科學院細胞庫) 用滅活小牛血清NBS與RPMI- 1640培養(yǎng)基配成10% 小牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞, 培養(yǎng)基中含硫酸鏈霉素 (100 mg ·mL− 1) 和青霉素G鈉鹽 (100 u ·mL− 1) 以避免細胞污染。細胞株培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2 無菌細胞培養(yǎng)箱中。 FITC攝取實驗 HeLa細胞以每皿 4× 104個接種于玻璃底的培養(yǎng)小皿內, 37 ℃ 、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育24h 。然后在皿中加入無血清 RPMI- 1640 培養(yǎng)液配制的FITC-penetratin 、FITC-[Cys2,9] penetratin 和 FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin, 濃度為2μmol ·L− 1, 培養(yǎng)箱中孵育 30 min 。再用pH7.4磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer solution, PBS) 洗滌細胞 3 次, 最后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內 FITC的熒光強度, 激發(fā)波長為 488 nm。 CPT 內化實驗 HeLa細胞以每皿 4× 104 個接種于玻璃底的培養(yǎng)皿內, 在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h, 然后在 皿中加入 2 μmol ·L− 1 CPT、[Cys-CPT2,9] penetratin, 放置于培養(yǎng)箱內孵育 30 min, 用 PBS 清洗細胞 3 次, 最后通過激光共聚焦在405 nm 波長下觀察細胞內的藍色熒光強度 (CPT 熒光)。 流式細胞儀檢測實驗 HeLa細胞以每孔 2× 105 個接種于12孔板中, 培養(yǎng) 24 h 后, 用 PBS 洗滌細胞3次, 然后將無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液配制的不同濃度 (1、2 和 5 μmol ·L− 1) 的FITC-penetratin、FITC- [Cys-CPT2,9] penetratin 溶液加入到培養(yǎng)板孔內, 與細胞共孵育30 min, 再用胰酶消化并收集細胞, 用預冷的PBS清洗樣品 3 次, 最后加入PBS 500 μL 重懸細胞, 流式細胞儀檢測熒光強度, 激發(fā)波長488 nm。 為了進一步證實FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 的穿膜效率, 選擇被廣泛研究證實穿膜活性強的穿膜肽 Transportan 10 (TP10) 作為陽性對照, 對 FITC-penetratin、FITC-[Cys2,9] penetratin、FITC-[Cys-CPT2,9]- penetratin 和 FITC-TP10 的穿膜效率進行分析和比較, 濃度設為 2 μmol ·L− 1。 細胞攝取的機制研究 為了研究 penetratin 與 [Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取機制, 采用不同內吞抑制劑探究它們對肽穿膜效率的影響作用。HeLa 細胞以每孔 2× 105 個接種于12孔板, 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h備用。先用PBS 洗滌細胞 3 次后, 在小孔內加 入無血清 RPMI- 1640培養(yǎng)液配制的不同抑制劑溶液 (10 μg ·mL− 1網格蛋白介導型內吞抑制劑 CPZ、50 μmol ·L− 1巨胞飲型內吞抑制劑 EIPA 和5 mmol ·L− 1小窩蛋白介導型內吞抑制劑 MβCD), 預處理30min, 然后在樣品孔內分別加10 μmol ·L−1 FITC-penetratin和2μmol ·L− 1 FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 繼續(xù)共孵育30 min。最后, 將收集到的細胞在流式細胞儀中 測定熒光強度。實驗中只加FITC-penetratin和FITC- [Cys-CPT2,9] penetratin 的樣品作為空白對照。 肽對腫瘤細胞增殖的影響 HeLa細胞以每孔 5 × 103 個接種于96 孔微板中培養(yǎng)24 h。將無血清RPMI-1640 培養(yǎng)液配制的 CPT、penetratin、[Cys2,9] penetratin、[Cys-CPT2,9] penetratin 溶液 (0.3125 、0.625 、1.25 、2.5和5 μmol ·L− 1) 分別加入到培養(yǎng)孔內, 孵育30 min后用PBS 清洗細胞, 然后加入含5%NBS的新培養(yǎng)液 180 μL, 繼續(xù)培養(yǎng) 72 h 后, 每孔加入MTT 溶液 (5.0 g ·L− 1) 20 μL, 繼續(xù)孵育4 h, 最后吸取上清, 每孔加入DMSO 溶液150 μL, 微板器上震動 5 min 后, 用酶標儀在 570 nm 處測定吸光度值 (OD)。細胞存活率 (%) =OD 藥物組 / ODcontrol × 100; 另外采用同樣處理方法考察以每孔 1× 104 個接種于96孔板的HeLa 細胞在 CPT、penetratin、[Cys2,9] penetratin和[Cys-CPT2,9] penetratin (1 、2 、5 、10 和 20 μmol ·L− 1) 作用1h后的存活率。 結果 1 細胞攝取 當 FITC 標記的 penetratin 系列肽與 HeLa 細胞共 孵育 30 min 后, 在激光共聚焦下能檢測到它們在細 胞內的綠色熒光。但在同一濃度下, 發(fā)現(xiàn)[Cys-CPT2,9] penetratin 組的細胞內熒光強度明顯高于 penetratin 和 [Cys2,9] penetratin 組, 結果顯示較多的[Cys-CPT2,9] penetratin 被攝入細胞內 (圖 2A)。說明改造后的[Cys- CPT2,9] penetratin 的穿膜能力明顯高于 penetratin。 圖片 流式細胞術實驗對 FITC-penetratin、FITC-[Cys2,9] penetratin、FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 和 FITC-TP10 的細胞攝取水平進行了直觀的比較。從圖 2B 可見, FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 的熒光強度高于 FITC- penetratin、FITC-[Cys2,9] penetratin 約 5 倍, 此結果與 激光共聚焦的結果一致, 顯示[Cys-CPT2,9] penetratin 具有更高的穿膜能力。[Cys-CPT2,9] penetratin 的穿膜 能力與陽性對照藥 TP10 相近。通過細胞攝取實驗證 實, 將 Cys-CPT 與 penetratin 第 2,9 位氨基酸替換后 得到的[Cys-CPT2,9] penetratin 具有明顯優(yōu)于母體的 穿膜能力。 2 [Cys-CPT2,9] penetratin 細胞攝取的量效關系 對 penetratin 和[Cys-CPT2,9]penetratin 細胞攝取進行更深入的量效關系研究。如圖 3 所示, 當HeLa胞與不同濃度的 FITC-penetratin 和 FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 共孵育30min 后, 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)兩 個肽作用后胞內熒光強度均隨濃度的增加而增加, 而各個濃度下 FITC-penetratin 的熒光強度均低于相同濃 度 FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 的熒光強度, 且 FITC- penetratin 的濃度增加到 5μmol ·L− 1 時, 它的細胞的熒光強度且略低于1 μmol ·L− 1時FITC-[Cys-CPT2,9] penetratin 所對應的熒光強度。 圖片 3 [Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取機制 不同內吞抑制劑 (網格蛋白介導型內吞抑制劑 CPZ 、小窩蛋白介導型內吞抑制劑 MβCD 、巨胞飲內 吞抑制劑 EIPA) 對[Cys-CPT2,9] penetratin 細胞攝取 的影響[20] 。如圖 4A 所示, 在母肽 penetratin 處理組 中, 發(fā)現(xiàn) 3 種內吞抑制劑 CPZ 、MβCD 和 EIPA 均可 明顯降低它的細胞攝取, 其中各個抑制劑作用后對 應的細胞攝取水平是 penetratin 對照組的 73% 、66% 和 56%; 在圖 4B 中, HeLa 細胞經 CPZ 和 EIPA 預處 理后, [Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取率明顯降低 至43. 1% 和 82%, 但MβCD 處理組的細胞攝取率與對 照組一致, 沒有表現(xiàn)出細胞攝取抑制作用。結果表明,[Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取機制主要是經由 網格蛋白、巨胞飲內吞通路內化進細胞的, 不經過細胞膜穴樣內陷過程, 與 penetratin 進入細胞途徑略有不同。 圖片 4 [Cys-CPT2,9] penetratin 誘導的細胞內CPT攝取量 為了考察 [Cys-CPT2,9] penetratin大量進入細胞時, 是否將CPT一起帶入細胞內, 從而發(fā)揮抗腫瘤活性, 利用激光共聚焦對CPT 內化情況進行直觀分析。如圖5所示, 在CPT的激發(fā)波下CPT 和 [Cys- CPT2,9] penetratin 組細胞內均能檢測到藍色熒光, 顯示 [Cys-CPT2,9] penetratin 導入細胞的同時自身所攜 帶的 CPT 隨之進入細胞內, 具有一定的抗腫瘤效應。 圖片 5 [Cys-CPT2,9] penetratin 的抗腫瘤活性 為了進一步證明[Cys-CPT2,9] penetratin 抗腫瘤活性, 采用MTT 法探討 [Cys-CPT2,9] penetratin 對HeLa作用不同時間后細胞的存活率狀態(tài)。在[Cys-CPT2,9] penetratin作用下, 細胞存活率表現(xiàn)出濃度依賴性, 對 HeLa 細胞的增殖具有抑制作用, 且抑制活性高于CPT組 (圖 6A), 而 penetratin 和[Cys2,9] penetratin 對 HeLa 細胞的增殖未產生任何影響。在圖 6B 中, [Cys- CPT2,9] penetratin 在短時間內也能抑制腫瘤細胞增殖, CPT 對 HeLa 細胞未產生明顯的殺傷作用, 進一步印證了[Cys-CPT2,9] penetratin具有高穿膜活性的同時 也具有抗腫瘤活性。 圖片 討論 在 CPPs 的二級結構圖中, 序列中的極性基團集中分布于結構一側, 而非極性基團集中分布于另一側, 從而形成雙親性的肽結構。肽的兩親性在它的穿 膜活性中發(fā)揮著非常重要的作用, 因此, 對CPPs 進行兩親性設計改造成為開發(fā)新型高效穿膜肽的策略之一[21−23]。本研究選擇 penetratin 作為母肽, 在不改變序列中堿性氨基酸及芳香性、 疏水性氨基酸等關鍵基團的前提下, 將2位Gln和9位Asn替換為疏水性基團 Cys-CPT 以期擴大母肽的疏水結構區(qū)域, 目的在于增加penetratin的雙親性, 進而得到更有潛力的穿膜肽[Cys-CPT2,9] penetratin。在激光共聚焦結果 中, [Cys-CPT2,9] penetratin 被攝入細胞內更多, 顯示它的穿膜活性明顯高于 penetratin, 表明penetratin 的雙親性增加后促進了穿膜肽與細胞膜之間的相互作用, 使更多的肽被細胞內化。同時流式數(shù)據(jù)也進一步證實了此結論, [Cys-CPT2,9] penetratin 具有更高的穿膜活性, 而比較 penetratin與[Cys-CPT2,9] penetratin量化結果發(fā)現(xiàn), [Cys-CPT2,9] penetratin 的熒光強度比 penetratin高5倍, 凸顯它的穿膜優(yōu)勢。 基于 [Cys-CPT2,9] penetratin具有較好的穿膜活性, 作者對它的穿膜機制進行了探索。目前普遍認可CPPs的穿膜機制是細胞內化過程[24, 25], 所以使用網格蛋白介導型內吞抑制劑、小窩蛋白介導型內吞抑制劑和巨胞飲型內吞抑制劑探究 [Cys-CPT2,9] penetratin 細胞攝取機制[18] 。結果顯示, 抑制劑CPZ、EIPA 均能降低 [Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取率, 這與penetratin攝取機制一致[13, 16] 。但是, [Cys-CPT2,9] penetratin的攝取過程中小窩蛋白未發(fā)揮作用, 這與 penetratin攝取機制有所不同, 可能是因為引入CPT基團影響了小窩蛋白介導的內吞作用[26, 27]。由此認為 [Cys-CPT2,9] penetratin 的細胞攝取機制是首先通過靜電作用與細胞膜結合, 然后通過疏水性作用與膜脂質結合, 最后由網格蛋白、巨胞飲介導的內吞途徑進入到細胞內。 由激光共聚焦實驗可見, CPT隨[Cys-CPT2,9] penetratin被細胞攝取, 抗腫瘤活性實驗也顯示 [Cys- CPT2,9] penetratin具有抗腫瘤活性, 且比 CPT抑制癌細胞作用更強, 表明[Cys-CPT2,9] penetratin 中引入Cys-CPT 基團不僅具有更好的穿膜活性, 也有抗腫瘤活性, 此結果與作者設計理念一致。高穿膜活性和抗腫瘤活性的 [Cys-CPT2,9] penetratin 在臨床應用中具有更大優(yōu)勢: 高效穿膜活性使 [Cys-CPT2,9] penetratin 可開發(fā)成潛在的藥物載體, 克服CPT在腫瘤治療中難以通透細胞膜和胞內轉運問題; 攜帶的CPT也通過凋亡通路誘使癌細胞死亡[28, 29] 。兩者通過協(xié)同作用來增強治療藥物的抗腫瘤活性, 同時也降低了化學藥物的給藥劑量, 有利于降低藥物的毒副作用及腫瘤耐受現(xiàn)象出現(xiàn)的幾率 �？傊�, 新型高效穿膜肽 [Cys-CPT2,9] penetratin的發(fā)現(xiàn)對后續(xù)腫瘤治療方案的研究和發(fā)展提供了前期基礎。 免責聲明：本文為行業(yè)交流學習，版權歸原作者所有，如有侵權，可聯(lián)系刪除 |
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