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中洪康康新蟲(chóng) (初入文壇)
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RNA提取少走彎路 已有2人參與
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1. 使用正確的細(xì)胞或組織儲(chǔ)存條件 在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲(chǔ)存在-80°C，千萬(wàn)不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會(huì)導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。 RNAfixer使樣品儲(chǔ)存更為便利。儲(chǔ)存在RNAfixer中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)星期，在4°C可穩(wěn)定保存長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月，或永久保存在-20°C。 2. 消除環(huán)境RNase的污染 為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個(gè)RNA制備過(guò)程中，當(dāng)RNA離開(kāi)強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時(shí)，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是無(wú)所不在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣?xùn)|西都是無(wú)RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺(tái)、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來(lái)處理過(guò)，去除各種溶液或者反應(yīng)緩沖液中可能存在的RNase污染，可以用RNAsafe。必須保證一直使用無(wú)RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。 3.迅速滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解 以下3個(gè)方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活： 1.用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。 2.用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保瞬間令RNA酶失活。 3.立即將樣品置于RNAfixer無(wú)液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中。它是一種水相、無(wú)毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠薄（<0.5 cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。 4. 選擇合適破壁方法 細(xì)胞或組織的徹底勻漿對(duì)RNA提取來(lái)說(shuō)，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來(lái)選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過(guò)簡(jiǎn)單的渦旋震蕩來(lái)勻漿；而動(dòng)物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說(shuō)細(xì)菌（特別是革蘭氏陽(yáng)性菌）的細(xì)胞壁，就需要溶菌酶消化來(lái)實(shí)現(xiàn)徹底的細(xì)胞裂解和RNA的最大回收，酵母提取時(shí)加入破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進(jìn)行提取。 5. RNA提取少走彎路——不同材料如何選擇最適RNA提取試劑 現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前最簡(jiǎn)單也是最安全的方法是柱式分離，如RNApure 因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單，時(shí)間短，純度高而受到大家的喜愛(ài)，RNApure不需要DNA酶消化DNA，節(jié)省了時(shí)間，避免RNA的降解，從而提高了產(chǎn)量；相對(duì)非柱式分離（如TRIzol），去除蛋白及其他雜質(zhì)干凈，提高了純度，對(duì)于細(xì)胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇，植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質(zhì)、次生代謝物含量的影響，一般用TRIzol提取純度不高，而且很多植物用TRIzol提取不出來(lái)。 這時(shí)候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等）和通用植物RNA提取試劑盒（適合絕大多數(shù)植物提取，包括：各種中草藥、植物種子、蘋(píng)果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹(shù)、杉樹(shù)、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍(lán)、牽�；ǖ龋�；非常值得一提的是血液（包括血清、血漿、腦脊液、各種拭子或其他液體含量高的樣本）RNA的提取用TRIzol和紅細(xì)胞裂解的方法效果都不好，因?yàn)榧t細(xì)胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分，這個(gè)過(guò)程RNA很容易降解，推薦使用TRIpure LS (RP1101)或者血液總RNA提取試劑盒（RP4001），該方法適用于表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)中RNA的提取，并成為博奧生物芯片北京國(guó)家工程研究中心的推薦方法 6. 低濃度RNA的沉淀 純化得到的RNA可能需要通過(guò)沉淀來(lái)濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5M 醋酸銨、2-2.5體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時(shí)，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓珼NA污染，糖原含量高會(huì)抑制PCR反應(yīng)，應(yīng)注意控制濃度，核酸助沉劑對(duì)PCR無(wú)影響，成為病毒核酸提取的首選。酵母RNA和未處理的糖原會(huì)給樣品帶來(lái)核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過(guò)分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。 7. 提取好的RNA如何儲(chǔ)存 如果只是短期儲(chǔ)存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20°C；如果是長(zhǎng)期儲(chǔ)存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。儲(chǔ)存RNA時(shí)，可以加入少量的RNA酶抑制劑（RP5601），避免RNA的降解，RNA可以直接做下游實(shí)驗(yàn)。如果要長(zhǎng)期保存RNA，可以加入RNAlong。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會(huì)避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
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