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ZZZZ0929新蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助，畢赤酵母表達(dá)蛋白
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求助大家，想要兩個(gè)基因到入畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室沒有基礎(chǔ)，想求助以下問題 1.質(zhì)粒線性化內(nèi)切酶的選擇： 按照文獻(xiàn)上選擇，質(zhì)粒1內(nèi)切酶在5 AOX1位點(diǎn)酶切，質(zhì)粒2在5 AOX1+目的基因酶切。是否改變第二個(gè)質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)即可（在5 AOX1處、不在目的基因處）。 是否需要考慮，兩個(gè)基因整合到畢赤酵母基因組不同位點(diǎn)？ 2.畢赤酵母化學(xué)轉(zhuǎn)化法是否可行？需要質(zhì)粒多少ug合適？ 電穿孔儀貨期要3-4月，且貴。查到之前用Licl/PEG3350，可以嘛。質(zhì)粒1大概有4 ug，質(zhì)粒2 15.6 ug 培養(yǎng)到OD多少合適，看到有0.8-1 有1-1.2 1.3-1.5 3.畢赤酵母PCR陽性克隆篩選： 引物是否找載體的通用測序引物就行？查到畢赤酵母破壁后可以直接進(jìn)行PCR，不用提取基因組DNA，這個(gè)信息對(duì)嗎； 4.載體抗性和篩選： 質(zhì)粒1是博來霉素抗性，質(zhì)粒2是Kana/Amp抗性，如果兩個(gè)均整合成功，是不是之后用Kana就行，還是要再加上博來霉素真菌抗生素呢 打算一個(gè)用組氨酸缺陷培養(yǎng)基篩選；一個(gè)用博來霉素篩選。查到可以依靠博來霉素濃度遞增來篩選拷貝數(shù)多的菌株，那第一個(gè)要怎么篩選呢 4.SG-His培養(yǎng)基是直接買現(xiàn)成的比較好嘛？還是買YNB自己配？ 組內(nèi)人都已經(jīng)問過，所以上網(wǎng)求助，謝謝大家 |
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2樓2022-08-10 20:32:01
ZZZZ0929
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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- 蟲號(hào): 29356767
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- 性別: MM
- 專業(yè): 藥物化學(xué)
3樓2022-08-11 13:41:11
4樓2022-08-11 13:57:23
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