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[求助] 求助帖：質(zhì)粒提取搖菌失敗求助已有1人參與

新手第一次做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，挑菌、提取，做的是PNL-4-3這個(gè)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化使用熱激法，質(zhì)粒+感受態(tài)細(xì)胞stbl3結(jié)合冰浴30min,熱激90s，在冰浴2min，加1ml的無抗LB培養(yǎng)基，搖1h，取10ml菌液鋪固體培養(yǎng)基，雖然長(zhǎng)菌挺密，但可挑出單菌落，然后10ml有抗培養(yǎng)基搖菌，搖了20管，過夜搖菌，渾濁了，然后用天根大抽提試劑盒，富集了將近200ml的菌體，嚴(yán)格按照說明書做，但最后提取出的質(zhì)粒濃度不到50ng/ul，純度OD260/280大于2，為什么呢？希望各位蟲友解答一下，感謝

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1樓 2021-01-22 11:22:54

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8樓: Originally posted by Sily2020 at 2021-01-23 15:19:00
那我是先用試管搖10ml，渾濁后，抽5ml，放錐形瓶搖100ml，可以嗎
...

還有，試劑盒的洗滌buff要加無水乙醇的

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10樓2021-01-23 18:35:08

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菌液搖的不夠渾，試管搖不開，用錐形瓶

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2樓2021-01-22 11:29:26

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還有涂平板，如果是質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，涂100-200微升菌夜就夠了。你10毫升怎么涂的？

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4樓2021-01-22 13:08:51

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5樓2021-01-22 14:50:32

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3樓: Originally posted by snoopyzxx at 2021-01-22 13:07:47
挑克隆后先用5毫升搖菌，保種一毫升。剩下的四毫升提取質(zhì)粒電泳鑒定。不要一來就大抽。小的證明沒問題再大抽。

我們實(shí)驗(yàn)室沒有做質(zhì)粒電泳的機(jī)器，所以沒法驗(yàn)證，只能大提

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6樓2021-01-23 15:15:08

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4樓: Originally posted by snoopyzxx at 2021-01-22 13:08:51
還有涂平板，如果是質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，涂100-200微升菌夜就夠了。你10毫升怎么涂的？

說錯(cuò)了，我用的是10ul涂板的，之前用的是100-200但每次都長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿了

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7樓2021-01-23 15:15:59

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2樓: Originally posted by wshdhr8 at 2021-01-22 11:29:26
菌液搖的不夠渾，試管搖不開，用錐形瓶

那我是先用試管搖10ml，渾濁后，抽5ml，放錐形瓶搖100ml，可以嗎

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8樓2021-01-23 15:19:00

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8樓: Originally posted by Sily2020 at 2021-01-23 15:19:00
那我是先用試管搖10ml，渾濁后，抽5ml，放錐形瓶搖100ml，可以嗎
...

挑斑可以直接加到錐形瓶里搖培，過夜能搖渾。你說的先用試管活化一下，試管太細(xì)，加的LB不宜太多，2-3-4毫升這個(gè)水平，白天搖幾個(gè)小時(shí)微渾，然后1：500 1：1000加到錐形瓶里過夜都行，只要方法對(duì)了，都能做出來。

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9樓2021-01-23 18:33:22

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