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C12ire1

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雙酶切后載體條帶很淺

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是載體和插入片段同時(shí)酶切過(guò)夜，用的EcoRI和BamHI，片段和載體都是50體系，且都加了500ng,試過(guò)把載體加到1000ng，跑出來(lái)的條帶是插入片段是亮的，載體條帶很淺，幾乎看不見(jiàn)，測(cè)了濃度是載體酶切后在1-2ng/ul,反復(fù)酶切過(guò)幾次都是這種結(jié)果，片段是1500bp，載體是改造載體1.6kb求大佬解答！

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1樓 2023-05-11 08:51:33

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ffplant

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【答案】應(yīng)助回帖

引用回帖:

10樓: Originally posted by C12ire1 at 2023-05-12 14:58:25
我也有過(guò)懷疑是否是酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，同時(shí)也懷疑是否產(chǎn)生星號(hào)活性，昨晚?yè)Q了ecroi的buffer，同樣也未改善多少，接下來(lái)試一下縮短酶切時(shí)間吧，那我大概酶切多長(zhǎng)時(shí)間呢，用的是賽默飛的酶，推薦時(shí)間是1-16小時(shí)
...

按推薦的最短時(shí)間試一下吧，你這種情況只能逐一排除問(wèn)題，要確定酶切時(shí)間的問(wèn)題、酶的問(wèn)題和載體的問(wèn)題，賽默飛的酶應(yīng)該挺貴的，你可以用比較便宜的限制酶單酶切一下觀察線性條帶大小是否準(zhǔn)確確定是不是載體的問(wèn)題

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11樓2023-05-12 16:54:54

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KM石頭

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

就實(shí)驗(yàn)描述來(lái)說(shuō)，應(yīng)該是質(zhì)粒本身出了問(wèn)題，載體在，酶切前有沒(méi)有重新測(cè)一下濃度，看是否降解；如果正常的話，建議重新提取載體質(zhì)粒，最后洗脫時(shí)，用水洗脫，同時(shí)注意260/230的比值，低于2.0的話，有機(jī)雜質(zhì)的污染可能會(huì)使其降解

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2樓2023-05-11 10:37:14

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ffplant

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看不太明白你的問(wèn)題是什么意思，是已經(jīng)連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化增殖后提的質(zhì)粒酶切有問(wèn)題還是載體和片段雙酶切后連接有問(wèn)題？

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3樓2023-05-11 11:53:23

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C12ire1

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2樓: Originally posted by KM石頭 at 2023-05-11 10:37:14
就實(shí)驗(yàn)描述來(lái)說(shuō)，應(yīng)該是質(zhì)粒本身出了問(wèn)題，載體在，酶切前有沒(méi)有重新測(cè)一下濃度，看是否降解；如果正常的話，建議重新提取載體質(zhì)粒，最后洗脫時(shí)，用水洗脫，同時(shí)注意260/230的比值，低于2.0的話，有機(jī)雜質(zhì)的污染可能 ...

其實(shí)我后面已經(jīng)重轉(zhuǎn)過(guò)了，結(jié)果也是差不多，就是感覺(jué)載體有問(wèn)題，但不知道問(wèn)題在哪兒，后續(xù)用酶切產(chǎn)物直接回收，沒(méi)有跑膠，得到過(guò)7-8ng/ul的濃度做了轉(zhuǎn)化，但沒(méi)有得到陽(yáng)性菌

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4樓2023-05-11 16:25:39

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