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臨藥藥

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pcDNA3.1雙酶切: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機(jī)app專屬紅包)

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雙酶切為什么切不開��？懷疑自連在切的時(shí)候加了SAP，也還是切不開。電泳后看到不加酶的質(zhì)粒跑在前面一小段，是不是說雙酶切切開了一邊？希望各位給點(diǎn)建議，謝謝！
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1樓 2025-02-19 23:18:00

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臨藥藥

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9樓: Originally posted by tianyu1201 at 2025-02-20 02:39:48
雙酶切你要確認(rèn)一下用的兩個(gè)酶反應(yīng)體系或者說buffer和溫度等一致。如果是兩個(gè)完全不同的位點(diǎn)是可以切開的賽默飛和neb的我都只用同品牌，問題不大。線性化載體切出來的跑電泳就會比環(huán)狀質(zhì)粒跑的慢，大小有區(qū)別是正常 ...

沒有膠回收，只是看跑的條帶，不加酶的質(zhì)粒跑在前面一點(diǎn)點(diǎn)。兩個(gè)酶都是takara的，都是37°，分別切了2小時(shí)也切不開。會不會是質(zhì)粒連上的這個(gè)基因不太好切了？
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10樓2025-02-20 08:30:46

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tianyu1201

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雙酶切你要確認(rèn)一下用的兩個(gè)酶反應(yīng)體系或者說buffer和溫度等一致。如果是兩個(gè)完全不同的位點(diǎn)是可以切開的賽默飛和neb的我都只用同品牌，問題不大。線性化載體切出來的跑電泳就會比環(huán)狀質(zhì)粒跑的慢，大小有區(qū)別是正常的�？站€性化載體切掉的部分不會很大，正常來說從電泳上看不出來單酶切和雙酶切片段的區(qū)別。切膠回收以后是插入片段連不上去還是長插入片段總是突變，讓你得到?jīng)]切開的結(jié)論？
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9樓2025-02-20 02:39:48

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引用回帖:

10樓: Originally posted by 臨藥藥 at 2025-02-20 08:30:46
沒有膠回收，只是看跑的條帶，不加酶的質(zhì)粒跑在前面一點(diǎn)點(diǎn)。兩個(gè)酶都是takara的，都是37°，分別切了2小時(shí)也切不開。會不會是質(zhì)粒連上的這個(gè)基因不太好切了？
...

你切的目的是連接還是驗(yàn)證？連接的話進(jìn)去的片段多大？
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11樓2025-02-20 11:23:51

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就算是同一品牌也會有普通酶和快切酶的區(qū)別啊，buffer什么的可能會存在不一致的情況，要確認(rèn)buffer貨號的。另外，如果是為了驗(yàn)證，可以試一試菌液PCR，單克隆能擴(kuò)出來合適大小的片段的也可以直接送測序驗(yàn)證啊
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12樓2025-02-20 11:26:25

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nono20093樓

2025-02-19 23:24 回復(fù)

臨藥藥(金幣+9): 謝謝參與

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tzynew2樓

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麥兜12127樓

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yudaoqian885樓

2025-02-20 00:01 回復(fù)

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tianyu12018樓

2025-02-20 02:33 回復(fù)

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秋土豆香6樓

2025-02-20 00:06 回復(fù)

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ylc63514樓

2025-02-19 23:53 回復(fù)

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